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分光光度法 50 管/48 樣
葡萄糖不僅是細(xì)胞能量代謝的主要底物,而且其代謝中間產(chǎn)物是生物合成的重要底物。植物可通過(guò)光合作用產(chǎn)生葡萄糖。就哺乳動(dòng)物而言,葡萄糖不僅是大腦神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、脂肪組織等的唯yi能源,而且與還原性輔酶、乳糖和乳脂的合成密切相關(guān)。
葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,并產(chǎn)生過(guò)氧化氫;過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫氧化
4-氨基安替比林偶聯(lián)酚,生成有色化合物,在 505 nm 有特征吸收峰。
可見分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽和蒸餾水
試劑一:0.5μmol/mL 葡萄糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 25ml×1 瓶,4℃保存;
試劑三:液體 25ml×1 瓶,4℃保存;
1、組織的處理:按照組織質(zhì)量(g):蒸餾水體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g組織,加入 1mL 蒸餾水),研磨成勻漿,95℃水浴 10 分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后, 8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。
2、細(xì)菌或細(xì)胞處理:收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):蒸餾水體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 蒸餾水),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3S,間隔 10S,重復(fù) 30 次),95℃水浴 10 分鐘(蓋緊,防止水分散失),冷卻后,8000g,25℃離心 10min,取上清液備用。
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm,蒸餾水調(diào)零。
2、混合試劑的配制:使用前將試劑二和試劑三 1:1 等體積混合,用多少配多少。
3、加樣表(在 EP 管中加入下列試劑):
試劑(μL) | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 |
樣本 |
|
| 100 |
試劑一 |
| 100 |
|
蒸餾水 | 100 |
|
|
混合試劑 | 900 | 900 | 900 |
混勻,置 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴中,保溫 15min,于505nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度??瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光值分別記為A1、A2 和 A3??瞻坠芎蜆?biāo)準(zhǔn)管只要做一管。
1、按樣本蛋白濃度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(V1×Cpr)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷Cpr。
2、按樣本鮮重計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/g 鮮重)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(W×V1÷V2)=0.5×(A3-A1)÷ (A2-A1)÷W
3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
葡萄糖含量(µmol/ 104 cell)= (C 標(biāo)準(zhǔn)×V1)×(A3-A1)÷(A2-A1)÷(500×V1÷V2)=0.001×(A3-A1)÷ (A2-A1)
C 標(biāo)準(zhǔn):標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5µmol/mL;V1:加入樣本體積,0.1mL;V2:加入提取液體積,1mL;
Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬(wàn)。
注意:低檢測(cè)限為 50nmol/g 鮮重或 0.5nmol/mg prot