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卡那霉素酶聯免疫試劑盒說明書

藥物概述及檢測原理

卡那霉素是氨基糖甙類藥物，被廣范應用于動物疾病的治療，由于其具有神經毒性和腎臟毒性，歐美國家及我國均要求其*使用。

本公司的卡那霉素酶聯免疫試劑盒使用新一代生物技術開發，具有方便、快速、靈敏等特點。

本試劑盒利用卡那霉素抗體與卡那霉素可產生特異性結合的性質，先在酶標板上預包被抗原，再加入標準品（樣本）和卡那霉素抗體工作液，樣本或標準品中的卡那霉素藥物與包被抗原競爭卡那霉素抗體，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標準品（樣本）中卡那霉素藥物的含量成反比。

• 試劑盒內包含組分：

1. 標準品工作液：0 ppb、0.2 ppb、0.6 ppb、1.8ppb、5.4 ppb、16.2ppb，
2. 1 mL/瓶。
3. 96孔酶標板：1塊
4. 卡那霉素抗體工作液：1瓶（7mL/瓶）
5. 酶標二抗工作液：1瓶（7mL/瓶）
6. 20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）
7. 20×濃縮組織復溶液：1瓶（10 mL/瓶）
8. 10×濃縮蜂蜜復溶液：1瓶（10 mL/瓶）
9. 底物A液：1瓶（7 mL/瓶）
10. 底物B液：1瓶（7 mL/瓶）
11. 終止液：1瓶（7mL）
12. 說明書
13. 蓋板膜

• 用戶需要自備的設備和試劑

儀器：

1. 酶標儀（檢測波長450 nm、630 nm）
2. 電子天平（精度：0.01 g）
3. 離心機（4000 g及以上）
4. 生化培養箱（可調25℃）
5. 搖床
6. 旋渦振蕩器
7. 微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）
8. 計時器

試劑：（試劑均為分析純）

1. 氫氧化鈉
2. 氯化鈉
3. 氯化甲鉀
4. 磷酸二氫鉀
5. 十二水合磷酸氫二鈉
6. 去離子水

• 試劑盒特異性

　　　試劑盒與其他藥物的交叉反應率：

1. 卡那霉素………………………100%
2. 大觀霉素、鏈霉素、替米考星…＜0.1%

• 樣本檢測步驟

1. 工作液準備

1. 組織復溶工作液：取1份20×濃縮組織復溶液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。
2. 蜂蜜復溶工作液：取1份10×濃縮蜂蜜復溶液加去離子水9份按照1:9的比例稀釋即得。
3. 緩沖液: 0.1M PBS溶液(PH=10-11)  稱取13.4g十二水合磷酸氫二鈉.20g氯化鈉.0.32g氫氧化鈉.0.5g磷酸二氫鉀.0.5g氯化甲鉀加去離子水溶解定溶至500ml。

1. 1 M鹽酸溶液：量取1ml濃鹽酸加去離子水11ml溶解混勻即得。

1. 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

1. 樣品前處理

組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數：20）

• 稱取1.0±0.05g均質樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入3ml緩沖液（見配液5.1），上下顛倒振搖5min；
• 放入60℃水浴環境中60min后，取出4000g以上，室溫離心10min；
• 移取上清液100ul，加入400ul組織復溶工作液（見5.1）中渦旋20s；
• 取50ul用于分析。

蜂蜜（稀釋倍數：15）

• 稱取1.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；
• 加入2ml 去離子水，強烈震搖2min （或使用渦動儀渦動1min）；
• 取100μL上清液至400μL蜂蜜復溶工作液（見5.1）中，充分渦動30s；
• 取50 μL液體進行分析。

   液態奶樣本方法一（稀釋倍數：10）（同四環素液態奶方

   法一致）

• 將采樣好的液態奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；
• 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；
• 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
• 使用離心機室溫4000 g以上離心10 min；
• 取上層清亮液體50μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入450μL組織復溶工作液（見5.1），強烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；
• 取50 μL液體進行分析。

   液態奶樣本方法二（稀釋倍數：40）（同四環素液態奶方法

   一致）

• 量取50ul液態奶樣品于1950ul組織復溶工作液（見5.1）中；
• 充分渦動1 min混勻；
• 立即取50ul進行檢測。

1. 檢測

• 準備：將要使用的酶標板條插入酶標板架上，并記錄各標準品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標準品點兩孔），未使用的酶標板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環境中以防變質；
• 加樣：向對應微孔中加入標準品工作液/樣品溶液50 μL，向每孔中加入50 μL酶標二抗工作液，再向每孔中加入50 μL抗體工作液，；
• 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應20 min；
• 洗滌：取出酶標板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復洗滌3~4次后，將酶標板倒置于吸水紙上，用力拍干；
• 顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質失效）；
• 孵育：輕輕振蕩酶標板10 s，使孔內液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應10 min；
• 終止：在反應后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍變黃表明終止成功。
• 讀數：終止后的酶標板應在5 min內用酶標儀讀數，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標板吸光度值。

1. 計算結果

• 設各標準品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標準（濃度為0 ppb的標準品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標準品（或樣品）對應的吸光度的百分比：
• 使用半對數系統代入標準品對應的吸光度的百分比，與標準品濃度擬合出標準曲線。
• 將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標準曲線方程中，即可得出樣品對應的濃度，后乘以樣品相應的稀釋倍數，即可得出樣品中檢測物含量。

• 試劑盒參數

• 試劑盒靈敏度：0.2 ppb；
• 標準曲線范圍：0.2 ppb-16.2 ppb；
• 板內變異系數：<5%；
• 板間變異系數：<15%；
• B0吸光度理想值：>0.8；
• 回收率：90%±30%
• 樣品低檢測限：

　　　　豬肉、雞肉…………約6ppb

　　　　蜂蜜…………………約5ppb

        液態奶樣本方法一…約5ppb

        液態奶樣本方法二約10ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

• 分析限制

　　　本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

• 試劑盒貯存條件

• 試劑盒貯存溫度為2-8℃，切勿凍存。
• 未使用完的酶標板條須密封保存2-8℃的環境中。

• 注意事項

• 使用試劑盒前，請務必仔細閱讀說明書。
• 試劑盒使用前，需將盒內各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。
• 試劑在使用前許搖勻，混合時應避免出現氣泡。
• 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復使用。
• 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。
• 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結果。
• 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍色，或混合后立即變藍，說明試劑已污染或變質。
• 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應時間差對檢測結果產生影響。
• 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎濺入眼，請在*清洗后去醫院檢查。

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